相信大家對 IHC 一定不陌生，世界那么大，實驗方法層出不窮，但是免疫組化卻是經典中的經典，想看看別的高大上的技術？不急，我們先來復習復習免疫組化。

免疫組化，免疫組織化學技術（immunohistochemistry），是一項利用抗原抗體反應，通過使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原，對蛋白定位，定性的實驗技術。

免疫組化主要用的是組織標本和細胞標本兩大類，組織標本包括石蠟切片（病理切片和組織芯片）和冰凍切片。石蠟切片，對組織形態保存好，保存時間也長，雖然對組織抗原暴露有影響，但可以抗原修復，所以石蠟切片仍然是首先選擇的標本制作方法。

好了，重點來了，下面是免疫組化步驟和經驗，各位看官不要錯過哦！

① 在 60°烤箱烤片 30~60min，這一步是為了使蠟片水分蒸發和石蠟融化，好讓組織切片牢固貼在玻片上。做切片是免疫組化的前提切片子最好是找專業培訓過的人員切片，片子的厚薄均勻，切片的完整，無褶無刀痕?？佳械豆さ臅r候。

② 脫蠟水化，依次放入二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各 10min，乙醇梯度（高至低）各 2min，水。然后用自來水洗一下，但不要直接對著切片沖洗。

③ 抗原修復，用的是高壓熱修復，ph6.0 的檸檬酸鹽緩沖液，一定要全部浸泡切片，等高壓鍋冒氣后 5min 結束，自然冷卻，溫度驟降可能引起脫片哦。3%H2O2 避光浸泡 15min （當然有的朋友用 EDTA 修復或者說使用微波修復等方法也是可以的，但是每一種抗體對不同的抗原修復方法的反應是不一樣的，得具體對待。） 

④ 這一步有神器，用“組傳"的免疫組化油筆圍繞組織畫圈，接下來就能看見它的功效了。 PBS 洗 5min x 3 次。PBS 會被鎖在畫的圈中，不會流干，保證不干片。 

⑤ 滴加 5%BSA （BSA 用 PBS 溶）稀釋的一抗，每個組織約 20ul，用 200ul 的槍頭尖的一端抹平，4°過夜或者 37°1~2h，這里用的是第二種方法。（每種組織大小不一樣，面積大概 1 乘 1 的可以 20ul 就夠了，對于類似 NPC 的組織就沒必要這么大了，關于一抗的問題，個人建議 4°過夜的方法，當然 37°1~2hour 也是可以的，兩種方法沒法說誰好誰不好，不同的抗體對方法的敏感性是不一樣的）再次 PBS 洗 5min x 3 次。 

⑥ 滴加二抗，一滴每個，用 200ul 的槍頭尖的一端抹平，室溫靜置 30min。（貨號 GK500705 的二抗檢測試劑盒，很好用，極力推薦。）

⑦ 再次 PBS 洗 5min x 3 次

⑧ DAB- H2O2 顯色 10min。（B：C=1:50，25ul 每個，現配現用），在這時要觀察，如果染色明顯，不到 10 分鐘即可蒸餾水洗終止顯色，但是一般超過 20min 都不會有什么好結果。 

⑨ Mayer 蘇木素染色 30s，水洗，鹽酸酒精分化 3s，流水浸 15min 

⑩ 脫水,乙酸 2min，乙醇梯度（低至高）各 2min，二甲苯 5min 

? 中性樹膠封片。

結果分析：

鏡下細胞核呈藍色，陽性結果呈深淺不一的棕色

結果分析主要有兩種方法，陽性著色細胞計數法和評分法。前者是在 40*光鏡下，隨機 10 個視野下計數陽性著色細胞；后者則是在光學顯微鏡下按染色程度（0 分陰性著色，1 分 淡黃色，2 分淺褐色，3 分深褐色）和陽性范圍（1 分 0-25%，2 分 26-50%，3 分 51-75%，4 分 76-100%）評分，最終分數相加。

再來看下反面教材 

較為常見的非特異性著色；還有背景過深的。要避免成為上述的兩種典型，做出一張可以見老板的結果，每步都要且做且思考。

啰嗦幾句：

1、脫蠟和脫水的步驟呢，每個實驗室都有自己獨到的方法，用的乙醇的梯度不*相同，大家按照自己的習慣那套來就好。但要注意，脫蠟和水化不全引起局灶性反應，會導致非特異性著色。 

2、一定要防止干片！干片也很容易引起非特異性著色。 

3、在用槍頭抹平抗體時，要盡量將槍頭放平，用斜面而不要用尖頭接觸組織，這一步要輕柔小心，可能你只是輕輕刮到幾下，但鏡下組織就變得亂七八糟的了（別問我是怎么知道的） 

4、PBS 在洗的時候，不要對著組織沖洗，會脫片。小編的方法是將沖洗著力點放在玻片的邊緣，讓液體自然流向組織。 

5、一抗濃度至關重要，這直接影響了最終的結果，摸條件時設置一抗濃度梯度。建議同時設置一個陽性對照，可以排除一抗之外的操作問題。 

6、背景染色過深的話，就要考慮一抗濃度過高或者一抗時間過長，顯色時間過長這些問題了。

7、降低組織非特異性染色，可以縮短一抗，二抗的時間，稀釋抗體，也可以增加幾次 PBS 沖洗。或者直接用單抗。

免疫組化往往作為檢測某蛋白在組織的表達情況出現在預實驗中，免疫組化的結果可能將直接影響課題的后續設計和進展。如果說我們的科研課題是一個大世界的話，免疫組化是我們看向這個世界的敲門磚。做好免疫組化，我們一起去更大的世界看看！