簡介

在動物細胞培養過程中，必須有可以貼附的支持物表面，其依靠自身分泌或培養基中的貼附因子才能在該表面生長增殖的離體動物的培養細胞。

由于血清具有終止胰蛋白酶消化，提供細胞生長所需的貼壁因子、免疫球蛋白、胰島素等其它營養成分及細胞因子，因此成為體外細胞培養液中的常用添加成分，其對細胞的培養意義重大。

原理

細胞在人工基質上單層生長（貼壁培養）
貼壁細胞分類：皮細胞型，成纖維細胞型，游走細胞型和多型細胞型。

在顯微鏡下觀察時，貼壁細胞在瓶底伸展并延伸成梭型或不規則的三角形或扇形或其它形態，而且晃動培養液時，細胞不動。

培養細胞在未貼附于底物之前一般均似球體樣；當與底物貼附后，細胞將逐漸伸展而形成一定的形態，呈成纖維細胞樣或上皮細胞樣等。

材料與儀器

【材料與試劑】細胞、PBS 或 DPBS、0.25% (w/v) Trypsin-EDTA、75% 乙醇、培養基（以DMEM為例）、100X 雙抗（鏈霉素-青霉素）、胎牛血清、細胞凍存液。

【實驗儀器與耗材】培養皿或培養瓶、移液槍、離心管、記號筆、封口膜、凍存管、程序降溫凍存盒、液氮罐、離心機、37℃ 恒溫培養箱（5% 二氧化碳濃度）、倒置相差顯微鏡、冰箱、無菌細胞操作臺。

步驟

一、試劑準備
DMEM*培養基（10% 胎牛血清）：44.5 mL DMEM +5 mL 胎牛血清+500 μL 100X 雙抗，搖勻，4 ℃ 冷藏保存，使用前于 37 ℃ 恒溫水浴鍋中預熱 15 分鐘。

PBS、*培養基、根據細胞特性選擇合適的解離液（例如Gibco? TrypLE? Express、胰蛋白酶）或機械吹打消化細胞、胰蛋白酶解離劑 0.25%  (w/v) Trypsin-EDTA 4℃ 冷藏保存，使用前于37 ℃ 恒溫水浴中鍋預熱 15 分鐘。

二、 細胞復蘇
1. 超凈工作臺使用前紫外線照射 30 分鐘。使用前，后用 75% 酒精擦拭臺面。保持臺面干凈整潔。使用時一定打開通風。

2. 將凍存細胞從-80 度冰箱或液氮罐中取出，立即放入（2分鐘內）37 ℃ 恒溫水浴中預熱水浴鍋中（或在手心中反復摩擦），不停晃動以化凍。

3. 立刻將化凍的細胞液轉移進裝有 3 mL DMEM*培養基的 5 mL離心管中并吸打均勻。注意液體不要留在瓶口或瓶蓋上，避免增加污染的可能。

4. 復蘇細胞時，離心機提前降溫至4℃，以 1000 rpm 的轉速將細胞懸液離心 5 分鐘并棄上清（離心的速度和時間根據細胞系的不同有所差異）。

5. 用 3 mL DMEM*培養基重懸細胞，并轉移進 6 cm細胞培養皿中，放入細胞培養箱中。

6. 在顯微鏡下觀察復蘇細胞的狀態（是否為單個細胞懸液，有無成團，活細胞的比例），并及時（每48小時）更換DMEM*培養基。

7. 當細胞密度占顯微鏡視野 80%-90% 時，應進行細胞傳代。

三、貼壁細胞傳代（以 6 cm細胞培養皿為例）
1. 棄置原培養皿中的培養基，從培養皿邊緣加入 2 mL 預熱的PBS平衡鹽溶液潤洗細胞（注意不要直接沖到細胞表面），并棄置。

2. 沿培養基側壁加入1 mL預熱的 0.25% (w/v) Trypsin-EDTA，使胰蛋白酶*覆蓋細胞表面。于細胞培養箱中孵育 2 min（孵育時間根據細胞系不同有所差異，如不確定細胞消化時間，每隔 1min 取出在顯微鏡下觀察，約有 50-70% 細胞飄起，即可繼續操作）。

3. 向培養皿中加入1 mL *培養基中和Trypsin的作用，并輕輕吸打細胞表層數次。將細胞懸液轉移到 5 mL 離心管中，在室溫下以 1000 rpm 的轉速將細胞懸液離心 3 分鐘。

4. 小心棄去離心管中的上清液，使用 1mL *培養基輕輕重懸細胞沉淀，使其*被吹打為單個細胞狀態，盡量減少泡沫的產生。

5. 進行細胞計數后以 1:3（1:3～1:6均可）的比例進行細胞傳代。

6. 取三只新 6 cm 細胞培養皿，每只培養皿中加入 3 mL *培養基，將細胞懸液平均分配至三只培養皿中，蓋上蓋子后，按照畫“十字"的操作，將細胞搖勻。

7. 細胞培養皿放入細胞培養箱中，繼續培養，每天觀察細胞狀態并及時更換培養液。

四、貼壁細胞凍存：
1、細胞處于生長對數期且狀態良好時，收集細胞以便凍存；

2、制備冷凍培養液（含DMSO），在 4°C 下保存。注：合適的冷凍培養基取決于細胞系種類。

3、按照貼壁細胞傳代培養過程中用的操作，將細胞解離下來；

4、600 g, 4℃ 離心 5 min 收集細胞，然后棄掉上清，從冰箱取出細胞凍存液重懸細胞，分裝至凍存管中；

5、將凍存管移入程序降溫盒中，再將程序降溫盒放入 -80℃ 冰箱，過夜，第二天移至液氮罐中。

注意事項

1、嚴格進行無菌操作，每次拿取東西時應使用75%乙醇噴灑表面進行充分消毒；

2、細胞培養皿上應清楚標記：操作人、時間、細胞系；

3、化凍細胞速度應快，盡量在 5 min 內完成操作；

4、離心管放入離心機前應用封口膜纏繞；

5、超凈臺使用前應用紫外照射 30 min 以上；

6、所有與細胞直接接觸的材料和儀器均應處于無菌狀態

7、如果使用培養瓶，在將其放回培養箱之前，若使用的培養瓶的瓶蓋不帶透氣孔，則需旋松瓶蓋，以便進行適當的氣體交換；

8、如果細胞培養基已冷藏（2-8°C），使用前在 37℃ 水浴鍋預熱；

9、細胞培養基保持避光儲存；

10、細胞培養基添加 FBS 后，將*培養基放入冰箱（2-8°C）以保持性能。并在 2-4 周內使用含添加劑的培養基，以減少污染機率和 pH 值變化的影響；

常見問題

1. 所有與細胞直接接觸的材料和儀器均應處于無菌狀態。

2. 如遇Trypsin 消化不佳的細胞（如RAW264.7細胞），可以采取使用無菌的細胞刮刀輕柔的將細胞刮下再處理。

3. DMSO 具有細胞毒性，復蘇細胞的過程操作要迅速，并用 3 倍體積以上的*培養基進行稀釋。

4. 細胞復蘇后應在 12～24 h 后觀察細胞狀態。如遇到細胞污染，應立即丟棄細胞，并對環境進行消毒。

5. 凍存細胞應選擇傳代次數較少的細胞，當細胞傳代高于15 代后，細胞應丟棄，復蘇新的細胞再進行試驗。

6. 復蘇后的細胞不能立即進行試驗，需傳代 2-3 代，待細胞生長狀態穩定后，才可進行相關試驗。復蘇后細胞狀態不佳，可考慮重新復蘇；

若重新復蘇后細胞狀態仍舊不佳，可考慮適當提高胎牛血清的比例（從10%提升至15%，最大提升至20%），待細胞狀態恢復后再使用平時使用的培養基。

7. 如想收獲到更多數量的細胞，可以將 6 cm皿細胞懸液接種于10 cm皿中，并增大*培養基的使用量。

8、復蘇細胞后細胞狀態差：1）首先，凍存細胞時選擇處于對數生長期狀態良好的細胞；2）復蘇時，水浴鍋提前預熱至37℃，離心機提前降溫至 4℃；

9、細胞交叉污染：1）培養細胞系時盡量不要多種細胞系同時培養；2）不同細胞系培養基單獨配置，盡量不要交叉使用；3）注意操作規范；